蛋白质组学是我国目前生命科学研究最热的领域之一，蛋白质组学的研究对提高我国生物医学原始创新能力、重大疾病防诊治能力和国民健康水平以及新药研发能力、生物医药产业的发展具有重大的战略意义。今天小析姐就和大家一起聊一聊蛋白质组学的三大支撑技术。
现在开始正题，什么是蛋白质组学，Proteomics includes not only the identification and quantification of proteins, but also the determination of their localization, modifications, interactions, activities, and, ultimately, their function。
我们主要讲的就是identification and quantification of proteins，这就引出了两类文章，第一种是尽可能多的鉴定细胞或组织中一切蛋白质，这一部分跟分析化学有关就不多讲，第二种是差异蛋白质组学，通过寻找各种因素引起的蛋白质表达差异，以解释细胞生理和病理机制。从医学角度来看，蛋白质组学整个实验流程简单易懂。第一步，不同组织或细胞样品间的蛋白质的分离，第二步蛋白质鉴定、定量，找出有显著表达差异的蛋白。第三步，在此基础上选定蛋白进行验证，最后生信分析（如下图）。其中分离有两套不同的流程，第一个是top-down(直接分离蛋白质），主要技术是二维电泳（不推荐，很麻烦）。第二个是buttom-up（分离蛋白质酶解后得到的多肽）,主要技术是LC。今天要讲的是top-down，文章发在oncotarget上，题目如下Identification of protein clusters predictive of tumor response in rectal cancer patients receiving neoadjuvant chemo-radiotherapy1、通过比较差异蛋白表达找出一个生物标志物来预测疗效好坏。2、根据疗效来设置3个组比较差异表达蛋白，用双向荧光差异凝胶电泳(2D-DIGE)来进行分离定量。3、通过2D胶图象分析软件找出30个显著差异表达的蛋白质点，其中16个点的表达在TRG1-2 vs TRG3有显著差异，14个点的表达在TRG1-2 vs TRG4有显著差异。作者用这里的30个点作为参数降维进行主成分分析，发现不管是TRG3还是TRG4与TRG1-2都可以很好的分开。另外还分析了30个点在正常与癌症组织中的表达情况。对比发现377、471、683和684四个蛋白质点的表达在TRG3 和TRG4 vs TRG1-2均有显著差异。471、683和684三个点在正常与癌症组织中表达有显著差异。4、将蛋白质点酶切成多肽，用nano-lc分离后用生物质谱鉴定蛋白质。5、将鉴定出的候选蛋白质用另一批病人来验证，最后用STRING进行了蛋白相互作用分析。该文思路简单，分离-鉴定-验证分析，是一篇经典的应用二维电泳来进行差异蛋白质组学分析的文献，值得参考。蛋白质组学（proteomics）采用高通量和大规模的研究手段，从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律，最终达到构建出细胞的“功能图”的目的。蛋白质作为生命活动的物质承担者、生理功能的执行者和生命现象的直接体现者，研究蛋白质对阐明生命体的变化机制具有重要作用。蛋白质组研究不仅可以实现与基因组的关联，揭示生命活动的发生规律。同样对人类重大疾病的发生与发展的病理机制研究也具有重要作用。生命体的生理、病理过程，药物和环境因子的作用都依赖于蛋白质，并引起蛋白质的变化。蛋白质组学研究对提高我国生物医学原始创新能力、重大疾病防诊治能力和国民健康水平以及新药研发能力、生物医药产业的发展具有重大的战略意义。2、比较蛋白质组学（比较不同蛋白质组的差异与相似性）；3、结构蛋白质组学（蛋白质三维结构的解析）；
4、功能蛋白质组学（蛋白质的功能和相互作用）；蛋白互作PPI图（STRING:https://string-db.org）
5、蛋白质组学研究的技术平台与生物信息学（分离、鉴定技术，分析软件和数据库）。蛋白质组学研究有三大支撑技术：分离技术、鉴定技术、分析技术蛋白质组学的研究，根据分离技术的不同可分为基于凝胶分离的蛋白质组学研究路线和基于色谱分离的蛋白质组学研究路线。二维凝胶电泳（2-DE）技术拥有超强的分辨能力，能够同时将数千种蛋白同时分离展示，而且它包括了许多蛋白质不同修饰形态的信息。2-DE是根据蛋白质等电点（pI）和分子量（MW）的不同，将混合蛋白质通过等电聚焦（IEF）和聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）在两个水平上进行分离，最后使众多蛋白能在等电点和分子量两个方向分开。2-DE的分辨率和灵敏度都很高，一般可分离1000至3000个蛋白质，最高可分辨达11000个蛋白质，因此目前被认为是最好的蛋白质分离技术。但是2-DE的样品制备难度很大，如若样品制备不成功，会导致多数二维凝胶结果无法使用，也就无法进行后续的定性、定量分析。所以2-DE实验对操作者的实验技能水平要求极高，让科研人员是又爱又恨。
2-DE的图像采集分析系统可以记录不同蛋白质斑点的位置、大小、染色深浅、pI和分子量大小。通过不同图谱间的比较，差异的蛋白质斑点被确定。将差异蛋白切割下来后酶解消化的到短片段的多肽，进一步的质谱分析可以得到肽段的氨基酸组成，进而确定具体蛋白质。
双向荧光差异凝胶电泳（DIGE）是在传统双向电泳的基础上发展而来的新型蛋白质组学定量技术，其分离蛋白的基本过程与传统双向电泳一致。但DIGE使用三种荧光染料（Cy2、Cy3和Cy5）标记不同组别的蛋白，并在同一张凝胶上对标记好的三组蛋白混合物进行电泳分离，是一种多通道分离技术。通常情况下，Cy3和Cy5分别标记两组蛋白；Cy2标记所有组别蛋白的混合物，作为内参使用。电泳分离后，在激光扫描仪中分别用相应波长的激光进行扫描，即可在同一张凝胶中得到三组蛋白的图谱。凝胶扫描后，用专用的Typhoon软件进行分析对比得到准确可靠的定量信息。相对而言，基于色谱分离的蛋白质组学技术在操作上就要简单的多，可操作性也更强。目前蛋白质组学技术服务商提供的项目也基本上采用此策略。色谱分离是使用外力使含有样品的流动相（气体、液体或超临界流体）通过一固定于柱或平板上、与流动相互不相溶的固定相表面。处于柱起始端的样品中各组份在固定相与流动相之间重新分配并随流动相流出。与流动相作用弱的组份随流动相流出的速度慢，而与流动相作用强的组份随流动相流出的速度快。由于流出的速度的差异，使得混合组份被分离，在不同的时间点流出，因而可以对不同组份物质分别进行定性、定量分析。基于色谱分离的蛋白质组学研究策略的蛋白定量、定性均采用质谱分析结果。蛋白混合物被酶解为短片段后进行色谱分离。质谱仪与液相色谱串联，分离肽段直接进入质谱仪并被离子化，一级质谱测定肽质量，检索得到相对分子质量的几个肽段。二级质谱得到碎裂的肽段离子信息，综合两者信息得到具体的肽段序列。定量信息则来自肽段质谱峰强度的积分面积。
蛋白质鉴定需要有对应的蛋白质组文库，质谱鉴定数据与文库蛋白模拟酶解片段比对得到肽段序列，再进一步比对蛋白得到鉴定蛋白结果（质谱鉴定原理、肽段、蛋白鉴定将在下一期介绍）。所以，模式物种或其它数据库收录较全的物种蛋白鉴定可以直接从数据库下载相应蛋白序列。而数据库没有收录的非模式物种则需要同时做无参转录组项目，然后进行蛋白的检测和分析。蛋白质组学的分析主要指蛋白的生信分析，依赖于数据库的建立。现在常用的蛋白质组学生信分析有GO功能分析和KEGG通路分析。GO（gene ontology）是基因本体联合会（Gene Onotology Consortium）所建立的数据库。根据基因产物的相关分子功能、生物学途径、细胞组分而给予定义，无物种相关性。KEGG（Kyoto encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因和基因组百科全书）是系统分析基因功能，它将基因组的信息与基因功能联系起来，旨在揭示生命现象的遗传与化学蓝图。旨在借助计算机全面地展示细胞和生物所包含的生物学信息；根据基因组中的信息，用计算机计算或者预测出比较复杂的细胞中的通路或者生物的复杂行为。近年来蛋白质组研究技术已被应用到各种生命科学领域，覆盖了原核微生物、真核微生物、植物和动物等范围，涉及到各种重要的生物学现象，如信号转导、细胞分化、蛋白质折叠等。生物信息学的发展已给蛋白质组研究提供了更方便、有效的计算机分析软件，随着基因组学的迅速推进，会给蛋白质组研究提供更多更全的数据库。另外，蛋白质组学与其它学科的交叉也将推动新技术、新方法的发展。特别是蛋白质组学与其它大规模科学如基因组学，生物信息学领域的交叉，所呈现出的系统生物学研究模式，将成为未来来生命科学新前沿。
